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MSC derivadas del cordón umbilical ayudarian a tratar el defecto periodontal inflamatorio

Introducción

La periodontitis es una enfermedad común y generalizada que, de no tratarse, puede causar la destrucción irreversible de la estructura de soporte dental y por tanto puede dar lugar a la pérdida de dientes [1]. Una vez endurecidos (hueso y cemento) y emblandecidos los tejidos conectivos (ligamento periodontal), la compleja estructura anatómica del periodonto desaparece, la regeneración del periodonto cobra una gran importancia clínica [2]. El objetivo final de la terapia periodontal es restaurar la estructura y función del periodonto dañado en un microambiente espacialmente definido, y controlar el estado de la inflamación y la progresión de la periodontitis.

Si bien los tratamientos periodontales y / o quirúrgicos convencionales generalmente logran prevenir la progresión de la enfermedad, aún no pueden regenerar el tejido periodontal perdido o su funcionalidad. Si bien se han utilizado distintas terapias regenerativas, como el tratamiento de regeneración tisular guiada (GTR, del inglés) [3], el tratamiento basado en múltiples factores de crecimiento [4] y la aplicación de un derivado de matriz de esmalte [5], los resultados no son satisfactorios, y presentan una deficiente predicción clínica [6].

Con el desarrollo de la biología celular progenitora e ingeniería tisular, las terapias basadas en células para la regeneración periodontal serán más eficientes y predecibles en superar las limitaciones de los tratamientos existentes [4, 7]. Se ha indicado que las células madre / progenitoras con capacidad para auto-renovarse y diferenciarse son el factor clave en la medicina regenerativa, que puede inyectarse directamente en el defecto o suministrarse al defecto por medio de andamios de biomaterial o portadores celulares [8-12] ]. Se evaluó la presencia de tejido periodontal experimental en una variedad de modelos animales [16-18], incluidos, entre otros, PDLSC, células madre mesenquimales de la médula ósea, células madre derivadas de tejido adiposo, células periosteales alveolares, células del folículo dental y células de la pulpa dental [13-15]. Entre estas células, se ha demostrado que las PDLSC son capaces de desarrollarse en células similares a osteoblastos y células similares a cementoblastos, así como producir tejidos alveolares, cemento y ligamentos periodontales in vivo [19-22], mostrando un poderoso potencial regenerativo para el tejido periodontal. En los últimos años, no solo se han utilizado los PDLSC en la regeneración periodontal de modelos de animales grandes y pequeños, incluidos perros y cerdos en laboratorio [23, 24], sino también en ensayos clínicos [25]. De hecho, las PDLSC son las células madre más utilizadas para la regeneración periodontal y son las candidatas principales entre las células madre dentales para las terapias regenerativas periodontales [7]. Sin embargo, dado que las PDLSC se aíslan de los dientes extraídos, la aplicación clínica de las PDLSC está muy limitada. Aunado a ello, las propiedades celulares se ven afectadas por el envejecimiento y el microambiente local de los donantes [26].

Las hUCMSCs, derivadas de los cordones umbilicales, son una fuente de células madre de bajo costo e inagotable. Su obtención no requiere el procedimiento invasivo de hPDLSCs y no esta asociada con las controversias asociadas con las células madre embrionarias humanas [27]. Además, las hUCMSC parecen ser MSC primitivas y exhibir una gran plasticidad y flexibilidad de desarrollo [28]. Además, las hUCMSCs han demostrado una inmunorresección in vivo mínima y no son tumorigénicos [28]. Estas ventajas hacen que las hUCMSC sean atractivas para las terapias regenerativas periodontales. Para determinar si las hUCMSCs podrían utilizarse como una fuente celular alternativa para la regeneración periodontal, aquí utilizamos las PDLSCs como un control para comparar los efectos terapéuticos entre las hUCMSCs y las hPDLSC en un modelo de defecto periodontal.

Además de la célula semilla, la estrategia de administración también desempeña un papel importante en el diseño de la terapia periodontal basada en células [4]. En este sentido, la tecnología de agregados celulares se ha establecido como una estrategia prometedora para la administración de células que puede producir una hoja de células interconectadas. Además, la tecnología de agregación celular facilita la separación de las células del sustrato de cultivo, de modo que las moléculas de adhesión natural en la superficie celular y las interacciones célula-célula permanezcan intactas [29-31]. Nuestro estudio anterior también demostró que el agregado celular tiene una capacidad promotora osteogénica más fuerte y podría secretar más ECM (matriz extracelular) [32]. Es un enfoque atractivo de regeneración periodontal para la administración de láminas celulares intactas sobre una raíz dental enferma, ya que simula las características anatómicas del ligamento periodontal, cuya presencia es necesaria para reformar la unión periodontal entre el hueso alveolar y el cemento de la superficie de la raíz [33].

En este estudio, planteamos la hipótesis de que las hUCMSC podrían ser una célula semilla alternativa para la regeneración periodontal y que tienen más ventajas que las hPDLSC en entornos inflamatorios.

Materiales y métodos

Aislamiento celular y cultivo.

El Comité de Ética (Junta de Revisión Institucional para la Investigación de Sujetos Humanos) de la Facultad de Estomatología, Cuarta Universidad de Medicina Militar (FMMU, por sus siglas en inglés) aprobó el consentimiento informado por escrito y fue proporcionado por todos los donantes o tutores para sus donaciones y uso posterior en este proyecto de investigación. Tras el consentimiento informado, se recolectaron premolares sanos impactados de tres pacientes adolescentes (12-19 años), cuyos dientes se extrajeron con fines de ortodoncia y estaban libres de cualquier infección clínica reciente. El cultivo primario de hPDLSCs se llevó a cabo tal como se describió anteriormente [34, 35]. Las hPDLSC se separaron brevemente y con cuidado de la parte media de la superficie de la raíz, posteriormente se cortaron en trozos pequeños (1 mm).3) [19, 35] y después se digirió con 3 mg / ml de colagenasa tipo I y 4 mg / ml de dispasa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 15 minutos. Se sembraron y se cultivaron suspensiones unicelulares (células de 2×103 )  en α-MEM con un 10% de suero bovino fetal (FBS), como se describe en informes anteriores [35]. Se usaron todas las hPDLSCs después de 2-4 conductos y se utilizó el mismo conducto para cada experimento. Se aislaron hUCMSCs y se cultivaron a partir de cordones umbilicales completos de bebés sanos en condiciones estériles [36]. Los cordones umbilicales se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la membrana externa y los vasos fueron aislados y eliminados. Los tejidos restantes fueron diseccionados manualmente en pequeños bloques y colocados en matraces de poliestireno con un medio de Eagle modificado por Dulbecco (L-DMEM) con bajo contenido de glucosa suplementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% (PS) (Invitrogen, Carlsbad, CA ) (medio de crecimiento hUCMSCs) durante 7 días. En este estudio se utilizaron células del pase 4.

Análisis de citometría de flujo.

Se detectaron fenotipos celulares de los pasos tempranos (P3) de las células cultivadas mediante análisis de citometría de flujo para medir la expresión de marcadores de superficie de células madre [37]. Se recogieron aproximadamente 5 × 105 células adherentes de hPDLSCs y hUCMSCs. Después, la suspensión unicelular se re suspendió y se incubó con anticuerpos para humano CD29  (FITC), CD90 (PE), CD146 (PE), CD105 (PE), CD31 (PE), CD34 (PE) y CD45 (APC) (BD Bioscience, San José, CA, EE. UU.) a 4 ° C. Las muestras se midieron mediante análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro Beckman Coulter Epics XL (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE. UU.). El experimento se repitió al menos tres veces.

Ensayos de unidad de formación de colonias de fibroblastos (CFU-F)

Se suspendieron un total de 1 × 103 suspensiones de células individuales de hPDLSCs o hUCMSCs (P3) en medio basal y se sembraron en placas de cultivo de 10 cm de diámetro (Corning, Lowell, MA, EE. UU.) para los ensayos CFU-F. Estas células se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con toluidina azul al 0,1% después de 14 días de cultivo. Se contaron agregados con ≥50 células vistas bajo el microscopio como colonias y los números de colonias por pocillo se contaron para el análisis de contraste entre los dos tipos de células. El experimento se repitió al menos tres veces.

Ensayo de proliferación celular.

Se llevó a cabo el ensayo MTT para evaluar la proliferación celular. Se colocaron hPDLSCs o hUCMSCs (P3) en placas (Corning) a una densidad de 2 × 103 células / pocillo y cultivadas en medio basal. Cada 24 h, el medio de 8 pocillos de cada línea celular se cambió a un medio sin suero y se añadió 20 μL de 5 mg / ml de MTT (3-(4,5- de bromuro-2-yl) -2,5-dimetiltiazol) de solución a cada pocillo y se incubó durante 4 h. Después de descartar el medio, se disolvieron sales de formazán en 150 µl de DMSO (dimetilsulfóxido, Sigmae Aldrich), y se leyó la placa a 490 nm con un lector de microplacas (ELx800, BioTek Instruments Inc., Highland Park, EE. UU.) [38, 39 ]. El ensayo de MTT se llevó a cabo cada día durante un período de cultivo de 7 días.

Ensayo osteogénico In vitro.

Se examinaron las múltiples capacidades de diferenciación de hPDLSC y hUCMSCs de acuerdo con informes anteriores [19]. Se cultivaron las células en medio osteogénico, es decir, medio basal suplementado con 50 mg / ml de L-ascórbico-2-fosfato (MP Biomedicals, LLC, Santa Ana, CA, EE. UU.), dexametasona 0,1 mM y b-glicerofosfato 5 mM (Sigma Aldrich), o medio adipogénico, es decir, medio basal suplementado con dexametasona 1 mM, insulina 10 mM, 1-metil-3-isobutilxantina (IBMX) 0,5 mM, e indometacina 200 mM (todas de Sigma Aldrich). Se usó el kit de desarrollo de color BCIP / NBT ALP (Beyotime, Haimen, China) para determinar la capacidad de diferenciación de la osteogénesis de hPDLSCs y hUCMSCs de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se llevó acabo el ensayo de cuantificación con el software Plus 5.0. Las células se fijaron con paraformaldehído de 4% durante 20 minutos y se tiñeron con Alizarin Red S de 2% (pH 4,2) (Kermel, Tianjin, China) o Oil Red o (Sigma) del 0,3%. Los nódulos mineralizados y las gotitas de lípidos fueron disueltas con cloruro de hexadecilpiridinio e isopropanol, y la absorbancia se midió cuantitativamente a 560 nm para el análisis estadístico, respectivamente.

Construcción de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA

Se sembraron un total de 3 × 105  hPDLSCs y hUCMSCs en una placa de 6 pocillos y se cultivaron en α-MEM con 10% FBS hasta que las células alcanzaron el 80% de influencia. Después, se cambió el medio a α-MEM (10% FBS) que contenía 50 μg / mL de vitamina C (VC), que se renovó cada 2 días. Después de aproximadamente 10 días, se pudo observar la estructura de la membrana blanca y la CA se tornó más gruesa con el tiempo.

Observación morfológica del agregado celular.

Las hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA cosechadas se fijaron con paraformaldehído del 4% durante la noche y se examinaron mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Además, se utilizó microscopía electrónica (SEM, Hitachi S-4300; EIKO Engineering, Tokio, Japón) para examinar la microestructura de las hojas de células resultantes. Brevemente, y después de lavarse en PBS tres veces, las hojas de células se fijaron con glutaraldehído al 2,5% a 0ºC., deshidratado y secado en un secador de punto crítico. El experimento se repitió al menos tres veces.

Evaluación de nicho in vitro de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA.

Después de 7 días de inducción osteogénica, la tinción con ALP de hPDLSCs-CA y hUCMSC-CA se realizó mediante un kit de desarrollo de color ALP (Beyotime, Shanghai, China) y la actividad de ALP fue cuantificado por un kit de detección de actividad ALP (Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China). Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para examinar la expresión del ARNm de ALP, Runx2 y OCN, así como el gen relacionado con la matriz extracelular, fibronectina, integrina-β y colágeno tipo I. Además, también el RT-qPCR detectó BSP y OPN, los cuales se expresan fuertemente en el periodonto nativo en el hueso y el cemento, especialmente el cemento acelular. Se aisló brevemente el ARN celular de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones estándar del fabricante. Se realizó la transcripción inversa del ARNm y la reacción de PCR como se describió anteriormente [40]. Las secuencias de cebadores utilizadas en este experimento se enumeran en la Tabla 1. Además, se detectaron por inmunofluorescencia la expresión de BSP, OPN, fibronectina, colágeno tipo I, OCN y osterix en ambos agregados celulares durante el período de inducción. El proceso experimental y el método de análisis fueron los descritos previamente [32]. El experimento se repitió al menos tres veces.

Gene……. Gene Primer sequence
ALP…….. Forward 5’-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3’…….Reverse 5’- CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3’
RUNX2…Forward 5’-CACTGGCGCTGCAACAAGA-3’………..Reverse 5’-CATTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3’
OCN……..Forward 5’-CCCAGGCGCTACCTGTATCAA-3’…….Reverse 5’-GGTCAGCCAACTCGTCACAGTC-3’
Fibronectin….Forward 5’- CACCCAATTCCTTGCTGGTATC-3’……Reverse 5’- TATTCGGTTCCCGGTTCCA-3’
Integrin β1….. Forward 5’- GTGAGTGCAACCCCAACTACACT-3’..Reverse 5’- AAGGCTCTGCACTGAACA CATTC-3’
COL-I……Forward 5’- CCAGAAGAACTGGTACATCAGCAA-3’………..Reverse 5’- CGCCATACTCGAACTGGAATC-3’
BSP………Forward 5’-GGGCAGTAGTGACTCATCCGA-3’…………Forward 5’-TCTTCATTGTTTTCTCCTTCATTTG-3’
OPN……..Forward 5’-TCTGGGAGGGCTTGGTTGTC-3’…………..Forward 5’-TTTCCTTGGTCGGCGTTTG-3’
TGF-β…. Forward 5’-CACGTGGAGCTGTACCAGAA-3’………………Reverse 5’-CCGGTAGTGAACCCGTTGAT-3’
β-actin… Reverse 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’…….Reverse 5’- CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’

La diferenciación osteogénica de hPDLSCs y hUCMSCs con tratamiento de lipopolisacáridos.

Se ha informado que el tratamiento con lipopolisacáridos (LPS) altera el potencial osteogénico de hPDLSCs y hUCMSCs. Para comparar los efectos de LPS en la diferenciación osteogénica de hPDLSCs y hUCMSCs, se añadió LPS (10 μg / mL, O55: B5, Sigma Aldrich) [41] al medio de inducción osteogénico y el medio de inducción se cambió cada 3 días. En el día 7, se realizó la tinción de ALP y se cuantificó la actividad de ALP para comparar la diferenciación osteogénica de hPDLSCs y hUCMSCs.   Además, se extrajo el ARN total para el análisis del nivel de expresión de TGF-β por RT-qPCR.

Trasplante in vivo

Tanto hPDLSCs-CA como hUCMSCs-CA mezcladas con 40 mg de partículas de β-TCP (Shanghai, Bio-lu Biomaterials Co., Ltd) se implantaron por vía subcutánea en la región dorsal de ratones inmunocomprometidos (machos de 4-6 semanas de edad; Fourth Military Medical University Animal Center, Xi’an, China) (3 animales por grupo de prueba) para investigar más a fondo la biocompatibilidad de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA in vivo. Todos los procedimientos con animales cumplieron con las pautas del comité del Cuarto Comité de Uso y Cuidado Intramuros de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar y cumplieron con las pautas NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio en este estudio. Los ratones desnudos se sacrificaron 8 semanas después de la cirugía y las muestras extirpadas se fijaron en formaldehído neutro del 4%. Después, se utilizó la microscopía electrónica de escaneo (SEM, Hitachi S-4300; EIKO Engineering, Tokio, Japón) para observar la microestructura de las hPDLSCs-CA, hUCMSCs-CA, b-TCP resultantes y las muestras extirpadas, respectivamente.

Procedimiento quirúrgico animal y diseño experimental

Se obtuvieron 42 ratas Sprague-Dawley hembras adultas (ratas SD, 250.7 ± 20.5 g) del Centro de Investigación de Animales de Laboratorio de la Cuarta Universidad de Medicina Militar (FMMU). Todos los procedimientos quirúrgicos se llevaron acabo bajo anestesia general inducida por inyección intraperitoneal de pentobarbital al 1%. Se indujo la periodontitis tal como se describió anteriormente [42]. Las ratas SD se inyectaron con 10 μL de LPS de Escherichia coli (1 mg / mL) en el aspecto medio lateral del primer molar mandibular derecho, mientras que el grupo de control recibió 10 μL de solución salina. Esta administración se repitió cada otro día en tres días separados hasta el final del período experimental de 30 días. El modelo de defecto periodontal de rata se modificó de King et al [43, 44]. Se separó brevemente el músculo masetero y el periostio que cubren la superficie bucal de la mandíbula del hueso como un colgajo para exponer la mandíbula. Se removió el hueso alveolar sobre las raíces del primer molar mandibular y el cemento que cubre las raíces del primer molar mandibular con una rebaba de cabeza redonda de tamaño 3 (Dentsply-Sankin KK, Tokio, Japón). El defecto quirúrgico, que era de aproximadamente 2,5 mm x 1,5 mm, se llevó a cabo con la ayuda de un aumento de 10-20x utilizando un microscopio de disección Leica y una iluminación montada en la cabeza. Tanto hPDLSCs-CA como hUCMSCs-CA cultivadas en ausencia de medio de diferenciación osteogénico portado por el β-TCP se implantaron en el defecto, con el lado del agregado celular del constructo hacia la superficie de la raíz denudada. Las muestras de la mandíbula se recolectaron 1 semana, 4 semanas y 8 semanas después de la cirugía y luego se analizaron mediante análisis de micro-CT en cada momento. Además, se realizaron análisis histológicos y morfológicos mediante tinción con H&E y Azan.

Micro CT

El sistema de micro-CT de Inveon (Siemens AG, Alemania) se aplicó para escanear las muestras de la mandíbula con una fuente de voltaje de 80 kV, corriente de 500 mA y resolución isotrópica de 14,97 mm. Las imágenes tridimensionales (3D) de los defectos fueron reconstruidas a partir de los escaneos por el software del sistema micro-CT.

Análisis histomorfométrico

Las muestras de la mandíbula recogidas 8 semanas después del trasplante se descalcificaron en una solución de EDTA del 17% durante 4 semanas y se incluyeron en parafina. Posteriormente, las muestras se seccionaron horizontalmente cada 5 µM y se sometieron a tinción con H&E o Azan para localizar el área del defecto. Se observó la formación y organización de tejidos regenerados mediante microscopía óptica y polarizada (BX50, Olympus Optical) y se evaluaron en al menos 6 campos seleccionados al azar de cada muestra con el software Image Pro Plus 6.0. La formación de hueso nuevo se definió como la isla ósea observada dentro del defecto. El porcentaje de formación de hueso nuevo se calculó dividiendo el área del defecto por el área del hueso nuevo. El nuevo cemento se definió como el tejido mineralizado formado en la superficie de la raíz desnuda con fibras insertadas de colágeno. El porcentaje de cemento nuevo se calculó dividiendo la longitud de toda la superficie radicular denudada por la longitud de la superficie radicular con cemento nuevo. El porcentaje de nuevo ligamento periodontal se calculó dividiendo la longitud de la superficie de la raíz con la unión funcional del nuevo ligamento periodontal por la longitud de toda la superficie de la raíz desnuda.

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados por el Statistical Package for Social Science (SPSS) versión 20.0. Los datos se evaluaron para la distribución normal y una varianza similar entre los grupos antes del análisis adicional. La significación se evaluó mediante las pruebas t de Estudiantes y el análisis de varianza (ANOVA). En todos los casos se realizaron tres experimentos independientes.

Resultados

Aislamiento y caracterización de hPDLSCs humanas y hUCMSCs

Las hPDLSCs y las hUCMSCs purificadas se obtuvieron con éxito de tejidos PDL y cordones umbilicales de bebés sanos y se propagaron in vitro en una superficie de plástico estándar con una morfología casi fusiforme o de fibroblastos.

Se llevaron a cabo pruebas de citometría de flujo para identificar los marcadores típicos de la superficie celular para MSC. Sobre la base de los controles establecidos (datos no mostrados), tanto las hPDLSCs como las hUCMSCs fueron positivas para los marcadores MS29 CD29, CD90, CD146, CD105, pero negativas para los marcadores hematopoyéticos CD31, CD34 y CD45 (Fig. 1 complementaria). Además, ambos se caracterizaron en términos de CFU-F (Fig. 1A, B), capacidad de proliferación (Fig. 1C) y capacidad de diferenciación múltiple detectada por la tinción con ALP (Fig. 1D, F), tinción con rojo alizarina S ( Fig. 1E, G) y tinción de aceite rojo O (Fig. 1E, H). Tanto las hPDLSCs como las hUCMSC mostraron capacidad de formación de colonias, mientras que la fracción de área de CFU-F / 200 de hPDLSCs fue significativamente mayor que la de las hUCMSCs (P <0.05) (Fig. 1A, B). Sin embargo, la actividad de proliferación de hUCMSCs fue significativamente mayor que la de hPDLSCs después de 5 días de incubación (P <0.05), aunque mostraron una tasa de proliferación similar durante los primeros 4 días (Fig. 1C). Después de cultivarse en medio osteoinductivo durante 7 días, tanto las hPDLSCs como las hUCMSC mostraron un aumento de colonias de ALP CFU-F (Fig. 1D). Después de cultivarse en medio osteo-inductivo durante 21 días, se observaron matrices extracelulares mineralizadas tanto en hPDLSCs como en hUCMSCs, tal como se muestra mediante la tinción con rojo de alizarina (Fig. 1E). En cuanto a la diferenciación adipogénica, tanto las hPDLSC como las hUCMSCs demostraron la formación de gotitas de lípidos, tal como se muestra mediante la tinción con rojo de aceite (Fig. 1E). El análisis cuantitativo mostró que las hPDLSCs tenían un potencial más alto que las hUCMSCs para la diferenciación tanto osteogénica como adipogénica (Fig. 1F-H).

Caracterización de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA

Después de 10 días de inducción con medio que contenía Vc, tanto las hPDLSCs como las hUCMSCs formaron un agregado celular completo (CA) que podía desprenderse en el borde de las placas y mostraba morfologías similares a membranas y marfil (Fig. 2A). La tinción de H&E reveló que las hUCMSCs-CA contenían más capas de células y más ECM que las hPDLSCs-CA (Fig. 2B). Además, el examen SEM mostró que tanto hPDLSCs-CA como hUCMSCs-CA establecieron una densa red celular similar a una película que retenía uniones estrechas entre las células. Además, hUCMSCs-CA mostró una superficie más lisa en comparación con hPDLSCs-CA (Fig. 2C).

Figura 1: Aislamiento y caracterización de células madre del ligamento periodontal humano (hPDLSCs) y células madre mesenquimales del cordón umbilical (hUCMSCs). (A) Imágenes representativas de fibroblastos de unidades formadoras de colonias (CFU-F) formadas por hPDLSCs y hUCMSCs a baja densidad de siembra después de 14 días de cultivo. (B) Comparación cuantitativa del área de fracción total de CFU-F entre hPDLSC y hUCMSCs. (C) Curvas de crecimiento de hPDLSCs y hUCMSCs determinadas por el ensayo de bromuro de 3- (4, 5 dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio (MTT). (D) Imágenes representativas de la tinción con fosfatasa alcalina (ALP) en hPDLSCs y hUCMSCs tratadas con medio de inducción osteogénica durante 7 días. (E) Las hPDLSCs y las hUCMSCs cultivadas formaron nódulos calcificados que se tiñeron positivamente para la tinción con Alizarin Red S después de 4 semanas de inducción osteogénica y formaron gotitas de lípidos rojos de aceite positivos después de 3 semanas de inducción adipogénica. (F) Comparación de las actividades de ALP entre hPDLSCs y hUCMSCs tratadas por medio de inducción osteogénica durante 7 días. (G) Comparación cuantitativa de la formación de nódulos mineralizados entre hPDLSCs y hUCMSCs en medio de cultivo normal (control) o medio de inducción osteogénico. (H) Comparación cuantitativa de formación de gotas de lípidos entre hPDLSCs y hUCMSCs en medio de cultivo normal (control) o medio de inducción adipogénico. Se realizaron tres ensayos independientes para cada población celular. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo (NS, p> 0,05, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).

Para evaluar la capacidad de osteogénesis de la CA, se realizó la tinción de ALP en hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. Los resultados indicaron que las colonias de ALP de CFU-F (Fig. 2D) y la actividad de ALP (Fig. 2E) de hPDLSCs-CA fueron significativamente mayores que las de hUCMSCs-CA. Además, la expresión de ARNm de ALP, Runx2 y OCN (Fig. 2F), así como BSP y OPN (Fig. 2G) de hPDLSCs-CA fueron más altas que las de hUCMSCs-CA. En comparación, los niveles de expresión de los genes relacionados con la ECM, que incluyen fibronectina, integrina β y colágeno tipo I, fueron significativamente más altos en hUCMSCs-CA que en hPDLSCs-CA, según lo determinado por RT-qPCR (Fig. 2H). Además, todos los resultados de inmunofluorescencia incluyen BSP, OPN, fibronectina, integrina β, colágeno tipo I, OCN y osterix estaban de acuerdo con los resultados descritos anteriormente (Fig. 3A, B).

Capacidad antiinflamatoria de hPDLSCs y hUCMSCs

Para comparar las capacidades antiinflamatorias de hPDLSCs y hUCMSCs en un microentorno inflamatorio, se exploraron la diferenciación de la osteogénesis y la expresión del factor antiinflamatorio TGF-β. Encontramos que, en condiciones inflamatorias, el potencial de diferenciación de la osteogénesis de las hPDLSCs está más gravemente afectado que el de las hUCMSCs (Fig. 4A, B) (P <0.05), como lo demuestra la tinción con ALP y la cuantificación de la actividad de ALP. Además, las hUCMSCs mostraron una mayor expresión de TGF-β que hPDLSCs después de ser tratado con LPS, el cual se refiere a un mediador crítico involucrado en la respuesta de inmunosupresión. Sin embargo, no existe diferencia entre ellos sin el tratamiento con LPS (Fig. 4C) (P> 0.05).

Biocompatibilidad de hPDLSCs-CA +β-TCP y hUCMSCs-CA +β-TCP in vivo

El material de armazón, β-TCP (Fig. 4E), combinado con diferentes agregados celulares (Fig. 4D), se trasplantó subcutáneamente en la región dorsal de ratones inmunocomprometidos para evaluar la biocompatibilidad. 8 semanas después del trasplante, el examen SEM (Fig. 4F, G) mostró que ambos grupos cuentan con una buena biocompatibilidad in vivo.

CA para la regeneración periodontal en defecto periodontal inflamatorio.

Formación de hueso nuevo

Para determinar el papel de la CA en la regeneración periodontal de defectos periodontales inflamatorios, inyectamos lipopolisacáridos (LPS) a las ratas y realizamos una cirugía de defectos periodontales para establecer un modelo de defectos periodontales inflamatorios.

Después utilizamos la combinación de CA y β-TCP para la terapia, y se utilizó β-TCP por si solo como control (Fig. 2 complementaria). Después de la administración de LPS y la cirugía del defecto periodontal, no se observaron secuelas postoperatorias adversas en todos los animales. Se realizó una reconstrucción por micro-TC 3D para detectar los tejidos óseos recién formados 1 semana, 4 semanas y 8 semanas después de la cirugía. Tal como se muestra en la Fig. 5, el tejido mineralizado que cubre el defecto pudo observarse en los grupos β-TCP, hPDLSCs-CA + β-TCP y hUCMSCs-CA + β-TCP, especialmente a las 4 semanas, mientras que, en el grupo en blanco, la mayoría de las superficies radiculares quedaron expuestas.

Figura 2: Morfología de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. (A) Imágenes macroscópicas representativas de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA en placas de cultivo. (B) Imágenes de tinción representativas de hematoxilina y eosina (H&E) de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. (C) Imágenes representativas de microscopía electrónica de barrido (SEM) de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. (D) Imágenes representativas de la tinción de ALP en hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA después de la inducción osteogénica durante 7 días. (E) Análisis cuantitativo de la actividad ALP en hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. Análisis de RT-qPCR de la expresión de los factores asociados a la osteogénesis clásica (F), marcadores de fenotipos de osteoblastos y cementoblastos (G) y matriz extracelular (ECM) (H) entre hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA a nivel genético.
Figura 3. Características de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA La inmunofluorescencia (A) y el análisis cuantitativo (B) mostraron la expresión de fabricantes de osteoblastos y cementoblastos (BSP, OPN), ECM (fibronectina, Col-I) y factores asociados a la osteogénesis clásica (OCN, osterix) de hPDLSCs-CA y hUCMSCs CA a nivel proteico.
Figura 4: La capacidad antiinflamatoria y la biocompatibilidad de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA. Las hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA tratadas con o sin LPS se cultivaron en medio de inducción osteogénica durante 7 días, y la capacidad osteogénica se determinó mediante tinción con ALP (A) y análisis cuantitativos (B). Expresión génica de TGF-β en hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA con o sin LPS, el tratamiento se midió mediante RT-qPCR después de la inducción osteogénica durante 7 días (C). Imagen macroscópica de agregados celulares (D) y microscopía electrónica de barrido (SEM) de partículasβ-TCP (E). Agregados celulares y partículas β TCP fueron combinados y se implantaron por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos, como se indica en las imágenes SEM de las muestras de hPDLSCs-CA (F) y hUCMSCs-CA (G), respectivamente.

También se pudo observar la formación de hueso nuevo en todos los grupos 8 semanas después de la cirugía, como lo demuestra el análisis histológico (Fig. 6A, B). Los tejidos óseos recién formados se distribuyeron principalmente cerca de las superficies radiculares expuestas dentro del área defectuosa (Fig. 6A). Los resultados semicuantitativos (Fig. 6B) indicaron que los grupos β-TCP, hPDLSCs-CA + β-TCP y hUCMSCs-CA + β-TCP tuvieron un porcentaje significativamente mayor de hueso recién formado que el grupo en blanco (P <0.05 ). Aunque los grupos hPDLSCs-CA + β-TCP y hUCMSCs-CA + β-TCP formaron más tejidos óseos que el grupo β-TCP (P <0.05), la diferencia entre estos dos grupos no tuvo una significación estadística (P> 0.05).

Nueva formación de cemento.

En comparación con el grupo en blanco, los grupos hPDLSCs-CA + β-TCP, hUCMSCs-CA + β-TCP, yβ-TCP generaron nuevos formaciones de cemento a las 8 semanas después de la cirugía (Fig. 6A, C) (P <0.05). No se observaron diferencias significativas entre los grupos hPDLSCs-CA + β-TCP y hUCMSCs-CA + β-TCP (P> 0.05), los cuales mostraron más formación de cemento que el grupo β-TCP (Fig. 6C) (P < 0.05).

Nueva formación de ligamento periodontal.

Ocho semanas después de la cirugía, el espacio del ligamento periodontal en todos los grupos experimentales no estaba mineralizado. Las nuevas fibras del ligamento periodontal en el periodonto reparado solo se pudieron observar en los grupos hPDLSCs-CA + β-TCP y hUCMSCs-CA + β-TCP (Fig. 6E). Además, las fibras del ligamento periodontal en estos dos grupos se orientaron regularmente sobre la superficie de la raíz, indicada por la tinción de Azan (Fig. 6E). El análisis cuantitativo también demostró que las diferencias no fueron significativas entre estos dos grupos (Fig. 6D, P> 0.05).

Figura 5: Imágenes representativas en micro CT de la formación de hueso nuevo. La formación de hueso nuevo (indicada por la flecha blanca) y la pérdida ósea de los huesos alveolares (barra blanca) se muestran para diferentes grupos en semana 1, 4 semanas y 8 semanas, respectivamente.

 

Figura 6: Análisis histomorfométrico de los tejidos óseos recién formados, cemento y fibras del ligamento periodontal. La tinción representativa de hematoxilina y eosina (H&E) (A) y la tinción de Azan (E) indicaron la formación de nuevos tejidos óseos, cemento y fibras del ligamento periodontal 8 semanas después de la cirugía. (BD) es el correspondiente análisis cuantitativo de la observación histomorfométrica. c: cemento; d: dentina; s: andamio; NB: hueso nuevo.

Discusión

La terapia basada en células representa un enfoque prometedor para lograr la regeneración periodontal [4, 7]. Debido a la baja actividad celular, la distribución desigual y la baja eficiencia de regeneración, una técnica convencional con inyección de suspensión de una sola célula mostró efectos promotores comprometidos en la regeneración de tejidos [45]. En comparación con las hojas celulares, los agregados celulares podrían regenerar defectos tisulares más grandes con una mejor morfología [46]. El objetivo de este estudio es comparar los efectos de promoción de hPDLSCs-CA y hUCMSCs-CA en la regeneración periodontal, y determinar si las hUCMSCs podrían usarse como nuevas fuentes celulares para la regeneración periodontal. Estudios anteriores ya han demostrado que las hPDLSC tienen un potencial de diferenciación múltiple [47, 48], y además demostraron que este tipo de células podrían usarse para la regeneración periodontal [8, 49]. La capacidad potencial de las hPDLSC en promover la regeneración periodontal se ha demostrado ya en varios modelos animales [13, 50-54], así como en algunos ensayos preclínicos [55, 56]. Es perfectamente sabido que las hPDLSC son capaces de formar un nuevo cemento en la superficie de la raíz del diente y restablecer nuevas uniones entre el cemento y el hueso alveolar [3, 57, 58]. Por lo tanto, las hPDLSC son ampliamente estudiadas debido a la regeneración periodontal.

Sin embargo, un inconveniente significativo sobre el uso de PDLSC en la regeneración periodontal es que la extracción de PDLSCs requiere la extracción de dientes. Además, los comportamientos biológicos de las PDLSC están estrechamente relacionados con la edad, el microambiente local y las condiciones sistémicas de los donantes [26]. Además, es bien sabido que los pacientes que necesitan regeneración periodontal están generalmente bajo condiciones inflamatorias crónicas, especialmente en el área de la defección periodontal. Estudios anteriores ya han demostrado que la capacidad de diferenciación osteogénica de las hPDLSCs está significativamente deteriorada en el microambiente inflamatorio [49], con una alta expresión de factores relacionados con los osteoclásticos [59]. Por lo tanto, se requieren nuevas fuentes celulares para la regeneración periodontal. En este sentido, las hUCMSC, que son células madre indiferenciadas de los cordones umbilicales de los bebés con un rechazo inmunológico mínimo, están ganando popularidad en este campo [60]. Las hUCMSC son mucho más jóvenes que las MSC aisladas del periodonto adulto y tienen una alta plasticidad y flexibilidad de desarrollo. Además, la fuente de hUCMSCs es abundante y son pocas las cuestiones éticas que están asociadas con hUCMSCs. Nuestro estudio indicó además que las hUCMSCs expresan marcadores de diferenciación osteogénicos como ALP, Runx2 y OCN. Además, las hUCMSCs también expresan marcadores relacionados con el fenotipo cementoblasto, incluidos BSP y OPN [61]. Además, encontramos que las hUCMSC muestran una capacidad de acumulación de matriz extracelular, propiedades antiinflamatorias y potenciales regenerativos en un entorno inflamatorio crónico, lo que indica que las hUCMSCs podrían ser una fuente de células prometedora para la reparación de defectos periodontales.

Estudios anteriores ya han demostrado que las hUCMSCs son células de siembra adecuadas para la regeneración de múltiples tipos de tejido. En un modelo animal de curación de fracturas óseas, un estudio indicó que la capacidad osteogénica de las UCMSC es similar a la de las BMMSCs [62]. Otros investigadores encontraron que, después de cultivarse en un medio condicionado por inducción neuronal durante 3 días, las UCMSC expresaron proteínas específicas de las neuronas y podían usarse en la reparación de los nervios [63]. Yang et. al [64] demostró que incluso podrían usarse UCMSC para regenerar la médula espinal dañada. Adicionalmente, estudios in vivo demostraron que las UCMSC también podrían mejorar significativamente el proceso y el pronóstico de las enfermedades inflamatorias relacionadas [65], lo que indica que estas células tienen capacidad reguladora de inflamación. Nuestro estudio por primera vez confirmó que las UCMSC tienen una mejor capacidad antiinflamatoria que las PDLSC, lo que las hace ventajosas para la regeneración periodontal en condiciones inflamatorias crónicas.

Uno de los desafíos para la aplicación de agregados celulares es la dificultad de administrarlos y asegurarlos en la superficie de la raíz del diente. Para ello, la elegir un material de andamio adecuado es de suma importancia en la ingeniería de tejidos. Las cerámicas de hidroxiapatita, fosfato tricálcico (TCP) o una combinación de ellas se utilizan ampliamente en los estudios actuales. En este estudio, tomamos β-TCP como el material de andamio. Ya se ha demostrado que este material exhibe buena biocompatibilidad y potencial de inducción osteogénica en estudios clínicos y en animales [50-52]. Además, β-TCP podría promover la diferenciación de MSC en áreas específicas [54, 55]. Los resultados in vivo de nuestro estudio también indicaron que el β-TCP solo podría dar lugar a la formación de tejido duro en el área de la defecación periodontal. La combinación de agregados celulares y β-TCP lograría además la formación de unión periodontal y la regeneración de cemento, promoviendo la regeneración periodontal funcional en modelos animales.

Nuestro estudio se centró en la regeneración periodontal utilizando diferentes agregados celulares en condiciones inflamatorias crónicas. Tras construir un modelo animal con defecto periodontal, se inyectó LPS en la papila interdental mandibular para parecerse a la inflamación crónica en periodontitis [56]. Se ha informado que las condiciones inflamatorias en este modelo mostraron una alta similitud con la periodontitis crónica humana [57, 58]. Además, los estudios han indicado que las hUCMSCs podrían modular la respuesta inmune secretando factores solubles, creando un medio inmunosupresor [26, 49].

En el presente estudio, las hUCMSCs mostraron un mejor efecto inmunosupresor que las hPDLSCs. Los estudios in vitro demostraron que las UCMSC podrían mostrar esta función al segregar más TGF-β.

Este estudio utilizó hUCMSCs para reparar los defectos del tejido periodontal en condiciones de inflamación crónica con el objetivo de encontrar una fuente de células de siembra favorable alternativa para la regeneración periodontal. Encontramos que, al igual que las hPDLSCs, las hUCMSCs podrían promover la regeneración de los tejidos duros periodontales bajo la condición de periodontitis inflamatoria. hUCMSCs-CA también podría promover la formación de nuevos anexos funcionales del ligamento periodontal, lo que sugiere que hUCMSCs-CA podría ser una alternativa a las PDLSCs para las terapias periodontales.

Abreviaturas

CA: agregado celular; hPDLSCs: células madre del ligamento periodontal humano; hUCMSCs: células madre mesenquimales del cordón umbilical humano; LPS: lipopolisacárido; β-TCP: fosfato β-tricálcico biocerámico.

Reconocimientos

Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de China (Nos.2016YFC1101400) y Nature Science Foundation de China (81470679, 31670995, 81570976,81500857).

Contribuciones de autor

FQ.Sh., SY. L. y LG.M. realizaron los experimentos y escribieron el texto del manuscrito principal. RT, FJ, y YD analizaron los datos. YJ. Z h. y HM. Z h. revisaron el manuscrito, ZhH. D. y J. diseñaron el proyecto y financiaron esta investigación. Todos los autores han revisado el manuscrito antes de su envío.

Material suplementario

Figuras suplementarias. http://www.thno.org/v07p4370s1.pdf

Conflicto de intereses

Los autores han declarado que no existe ningún interés en competencia.

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