Exosomas y su potencial como biomarcadores para detectar el cáncer.

Exosomas y su potencial como biomarcadores para detectar el cáncer.

El reto más importante para tratar el cáncer es el diagnóstico en las etapas primarias. Si bien las características clínico-patológicas clásicas del tumor definen el pronóstico, los  avances en el diagnóstico y el tratamiento aún están en deuda con respecto a los biomarcadores moleculares y la posibilidad de detectar el cáncer en el estado pre-invasivo.

Por otro lado la eficiencia de las opciones terapéuticas disponibles es aún baja, y la quimioterapia continúa siendo el tratamiento principal debido a la falta de suficiente especificidad en los objetivos. Encontrar los nuevos biomarcadores no invasivos para el cáncer sigue siendo un reto clínico importante que no se ha alcanzado aún. Existen tecnologías actuales para escanear, diagnosticar, pronosticar, y tratar el cáncer, pero las limitaciones de estas implementaciones y procedimientos son innegables. La biopsia líquida como un método no invasivo tiene un futuro prometedor en este punto, y los exosomas son una de las áreas recientes que han acaparado mucha atención.

En esta reseña, se resume la capacidad potencial de los exosomas para diagnosticar el cáncer, con un enfoque especial en el cáncer de mama por ser  la segunda causa de mortalidad de cáncer en mujeres alrededor del mundo. Aborda las razones para elegir los exosomas para la biopsia líquida y los estudios relacionados con diferentes biomarcadores potenciales encontrados en los exosomas. Por último, dado que elegir el método para los estudios de exosomas es muy difícil, se proporciona un resumen de las diferentes técnicas.

La identificación de biomarcadores específicos es necesaria para la detección temprana del cáncer y así poder vencerla. Debido a las características heterogéneas de la mayoría de los tumores y los diferentes perfiles genómicos, las biopsias convencionales no pueden reflejar la naturaleza completa de los tumores primarios o secundarios (área de metástasis). Cada biopsia de tejido proporciona un pequeño tamaño de muestra y no refleja la heterogeneidad del tumor, el cual es esencial para decidir un tratamiento..1,2 Además, para conocer la respuesta que está teniendo la terapia, se requiere de un muestreo repetido de células cancerosas para identificar los cambios genéticos del tumor durante el tratamiento del cáncer, pero después de la cirugía, no se puede acceder al tumor para que sea monitoreado durante el tratamiento.3 En consecuencia, se requiere de un nuevo muestreo de bajo costo y no invasivo para la detección temprana, el chequeo y la investigación de la dinámica tumoral, así como el riesgo de recaídas.4 El aislamiento de materiales genéticos a partir de biolíquidos es un método nuevo y poco invasivo para diagnosticar diferentes tipos de cáncer. En la mayoría de los cánceres, algunos compartimientos de células tumorales (p. Ej., ADN, exosoma, etc.) o incluso las células cancerosas completas se segregan del volumen original del tumor y entran en el torrente sanguíneo o en cualquier otro biolíquido.5 En cuanto a las biopsias tumorales directas, la facilidad de poder obtener los biolíquidos los convierte en una fuente alternativa atractiva para la aplicación clínica. La liberación de exosomas de células cancerosas heterogéneas en bio fluidos podría proporcionar la información potencial de los tumores.3,6

Los exosomas fueron reportados por primera vez por Pan y Johnstone7 en 1983 en la Universidad de McGill durante la cultivación de reticulocitos de oveja. Estas vesículas lipídicas de dos capas con orígenes endocíticos se liberan en la región extracelular8 por una variedad de células de mamíferos, incluyendo células cancerígenas.9 Los exosomas de diferentes tipos de células encierran diferentes proteínas que tienen funciones importantes en su biogénesis y se utilizan como marcadores para su reconocimiento en procedimientos experimentales. Algunos ejemplos de estas proteínas son la familia Rab GTPasa,10 tetraspaninas (CD9, CD81,11 y CD6312), anexas,13 y chaperones (proteína de choque térmico [HSP] 7012 y HSP9014). Los exosomas son secretados en una amplia gama de bio fluidos, incluido el suero,15 orina normal y maligna,16 plasma, leche materna, saliva,17 derrames pleurales malignos,18 fluido de lavado bronquial,19 muestras oculares, lágrimas,20 líquido de lavado nasal,21 semen,22 fluido sinovial,23 fluido amniótico, y suero asociado al embarazo.24

La reseña actual analiza las ventajas de la biopsia líquida, especialmente la leche como un líquido de mama específico para estudios basados en exosoma. Después se investigaron los diferentes estudios de exosomas relacionados con el diagnóstico, el tratamiento y la respuesta al tratamiento en el cáncer de mama (BC)16 . Finalmente, se analizaron estudios recientes sobre materiales genéticos exosómicos en el campo de los biomarcadores del cáncer, y el estudio se concentró en diferentes métodos relacionados con los trabajos de laboratorio en exosomas de cáncer.

Razones alentadoras para usar exosomas para una biopsia líquida

Las biopsias tradicionales, como la aspiración con aguja fina, dependen del acceso a las células tumorales25, pero la biopsia líquida basada en exosomas se basa en partículas subcelulares y sus cargas. En comparación con las otras fuentes de biopsias líquidas, los exosomas tienen superioridad en diferentes aspectos. En primer lugar, en comparación con otras partículas subcelulares, como los cuerpos apoptóticos y las micro vesículas, los exosomas son más homogéneos en términos de tamaño, 26 y su apariencia en forma de copa los hace fácilmente distinguibles a través de microscopía electrónica.27 En segundo lugar, a diferencia de las células tumorales circulantes (CTC) que se cree que son una nueva fuente de biomarcadores del cáncer,6 se han desarrollado muchos protocolos de aislamiento y caracterización para utilizar los exosomas en la investigación y la terapia.28 Existen muchos kits comerciales que nos permiten aislar de forma rápida y eficiente los exosomas de una pequeña cantidad de líquido del cuerpo humano.29 En tercer lugar, los exosomas expresan marcadores específicos que incluyen HSP70 y Alix, que se pueden aplicar para separar los exosomas de otras vesículas subcelulares.30 Además, los exosomas pueden reflejar los marcadores celulares originales al presentar proteínas de superficie específicas31 e incluso sus células diana.32 Estas características permiten un fácil aislamiento tanto del tejido como de los exosomas específicos de las células diana. En cuarto lugar, los exosomas son estables en la circulación33 y se encuentran en casi todos los fluidos corporales potenciales; por lo tanto, pueden usarse como herramientas de diagnóstico para muchas enfermedades, incluida la BC. Uno de los receptores dirigidos a anticuerpos clínicos de BC portados por exosomas, HER2,34 podría desencadenar la idea de utilizar HER2 exosomal como herramienta de pronóstico a través de la biopsia líquida. En quinto lugar, el contenido de ácido nucleico de los exosomas es una fuente práctica para la investigación del cáncer. El contenido de ADN bicatenario de los exosomas puede mostrar el estado mutacional de la célula original.35 Además, los exosomas representan sus perfiles de proteínas y de ARN paterno-específicos,33 y su arquitectura protege el ARN circulante y el microARN (miARN) de la función catalítica de la ARNasa.36 Los ARN circulares en los exosomas son más diversos que los de la célula origen.37 Por lo tanto, los ácidos nucleicos exosómicos pueden utilizarse para encontrar firmas genéticas en pacientes con cáncer.38 Las bases de datos como ExoCarta39 y la base de datos de la proteína del exosoma urinario40 facilitan el intercambio de datos sobre el contenido de ácidos nucleicos y proteínas de los exosomas.

Exosomas derivados de la leche materna y del fluido mamario

La mayoría de los estudios basados en biomarcadores en BC se centran en exosomas derivados de la sangre. La mayoría de las células del cuerpo humano, incluidas las células del tejido mamario, liberan sus exosomas en la sangre.41 Por lo tanto, la concentración de exosomas específicos de mama (BSEs) parece disminuir en las muestras de sangre. Sin embargo, los fluidos mamarios, especialmente la leche, pueden estar llenos de BSE. Por tanto, la leche materna puede ser una fuente más confiable para estudios de exosomas y encontrar biomarcadores específicos. Hipotéticamente, los BSE pueden tener marcadores específicos del tejido mamario que les permiten unirse específicamente a las células BC y podrían usarse en nano ingeniería y terapia dirigida. Además, la recolección de leche humana en grandes escalas con fines comerciales es más práctica y menos invasiva que la del suero humano. El rendimiento de los exosomas derivados de la leche (335 mg / L) es suficiente para fines comerciales.42 En este sentido, los científicos rastrearon los exosomas de la leche humana utilizando su perfil de proteínas (incluidos CXCL5, MIA y KLK6).43 Un estudio demostró que se utilizaron exosomas de leche bovina cargados con fármacos para inhibir la proliferación de células BC humanas (MDA-MB-231 y T47D). Se concluyó que los exosomas derivados de la leche bovina aumentaban la estabilidad y la captación celular del fármaco. El efecto regulador de la leche humana en el sistema inmunológico ya está demostrado;44 los investigadores presentaron el impacto anticancerígeno de los exosomas lácteos por la vía de NF-KB en las células H1299.42 Además, en 2016, Yassin et al.45 propuso que los exosomas de leche de camello se pueden utilizar como nano transportadores potencialmente seguros. Curiosamente, los exosomas de la leche humana contienen altos niveles de factor de crecimiento transformante b2 (TGF-b2) y que podrían promover la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) en las células mamarias MCF7 y MCF10A. Por lo tanto, la secreción de TGF-b2 en la leche materna podría aumentar el riesgo de AC.46 En el caso contrario, los exosomas de leche bovina disminuyeron la viabilidad de las células BC in vitro.47 La estabilidad de los exosomas de leche bovina en condiciones ácidas del sistema digestivo lo hace ideal para la aplicación oral. La carga de exosomas de leche bovina con paclitaxel (PTX) aumentó la eficacia terapéutica y redujo la toxicidad sistémica en comparación con la PTX libre en un modelo animal para el cáncer de pulmón.48 Un estudio reciente evaluó la capacidad de los exosomas derivados de la leche para optimizar el suministro de curcumina a las células cancerosas. El estudio mencionado demostró que los exosomas de leche encapsulados con curcumina tenían mayor solubilidad en soluciones hidrofílicas, lo cual elevó el suministro de curcumina a las células cancerosas. La curcumina exosomal era estable en las condiciones del sistema digestivo, así como la endocitosis por las células intestinales humanas in vitro.49 En conclusión, los exosomas de la leche podrían ser portadores de medicamentos rentables y adecuados para la aplicación oral. Investigaciones futuras sobre los exosomas humanos de la leche materna podrían ayudar a descubrir nuevos papeles en la administración de fármacos.

El papel de los exosomas en el diagnóstico de BC, el tratamiento y la resistencia a la terapia

Diagnóstico

Al igual que otros cánceres, los exosomas relacionados con el tumor BC ejercen múltiples funciones en el crecimiento del tumor, la metástasis y la quimio resistencia. Los exosomas y sus componentes (ADN, ARN y proteínas) pueden influir en el escape inmune, la invasión tisular, la metástasis y la angiogénesis.50 La existencia de miRNAs exosómicos circulantes podría ser un biomarcador de diagnóstico para los tumores malignos de mama. Las células triple negativas BC (TNBC) producen exosomas que contienen ciertas proteínas y miRNAs (Figura 1), que dan  lugar a la transformación maligna. En comparación con las células malignas,

Figura 2. El papel propuesto de los exosomas en el tratamiento de BC

(A) Las células Hs578T transfectadas con miR-134 liberaron exosomas que llevan miR-134 que pueden regular negativamente la expresión de STAT5B y HSP90. Además, estos exosomas reducen la migración y la invasión, y aumentan la sensibilidad al fármaco anti-HSP90 en células Hs578T secundarias. (B) Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVE) liberaron los exosomas que expresan en exceso miR-503 después del tratamiento con PTX y EPB. Estos exosomas tenían el potencial de reducir la invasión de BC y la expresión de ciclina D2 y D3 que condujo a una disminución en la proliferación de células BC. (C) Células renales embrionarias humanas (HEK239) se transfectaron con proteína GE11 (se une específicamente a las células que expresan EGFR) y let-7a miRNA. Las células HEK239 liberaron exosomas que expresan GE11 y expresan let-7a, que se unen específicamente a los tejidos BC del xenoinjerto que expresan EGFR, e inhiben el desarrollo de tumores en modelos animales.

Las células normales liberan exosomas que empaquetan miRNA neutros.51 Varias investigaciones mostraron correlación entre miRNA exosomal (miR-195,52 miR-21,53 miR-484/19154) y tumorigénesis y estadios patológicos. Hannafon et al.41 indicó que los niveles de miR-21 y miR-1246 eran más altos en los exosomas plasmáticos de los pacientes con BC en comparación con los de las muestras de control. Además, curiosamente, el resultado del estudio de Palma et al.51 demostró que los exosomas liberados por las células BC pueden clasificarse en función de su contenido de miARN. El análisis del pequeño contenido de RNA de los exosomas séricos de cinco pacientes con BC mediante la técnica de secuenciación de RNA (RNA-seq) mostró que el diagnóstico de BC se asoció con cambios en los niveles de subtipos específicos de miRNAs.55 En 2016, Fiskaa et al.56 evaluó el contenido de ARN pequeño completo de nueve líneas celulares BC e indicó firmas exosómicas pequeñas de ARN para identificar líneas celulares BC entre sí y también de aquellas de otras líneas celulares que no son BC. Con base en los abundantes estudios centrados en el papel de los exosomas en BC, Park et al.57 diseñó un kit de diagnóstico. Este equipo útil mide la cantidad de 10 miRNAs en exosomas derivados de tumores de mama. La agregación de algunos miRNAs indica muestras de BC y una cantidad disminuida de ellas se dirige a muestras normales.57 En resumen, el contenido de miRNA de los exosomas biolíquidos se puede aplicar potencialmente en el diagnóstico temprano y la estadificación de los pacientes con BC.

Además de los miRNAs, algunas proteínas se expresan diferencialmente en ciertas etapas y tipos de BC, que se ubican en los exosomas extraídos. Por ejemplo, CD24, probablemente como biomarcador de BC en etapa tardía,58 existe en los exosomas serales.59 En 2005, Ryan et al..60 demostraron que survivina y sus variantes de empalme se expresaban diferencialmente en tejidos BC y tenían diferentes papeles en la apoptosis de las células BC. En consecuencia, Khan et al..61 consideraron que las células BC liberaraban survivina empaquetada en los exosomas. Después, encontraron survivin-2B como un marcador antiapoptótico en los sueros de pacientes con BC. Por lo tanto, el análisis de expresión de survivin-2B puede servir como un marcador de diagnóstico y pronóstico en las etapas tempranas de BC.62

Tratamiento

Investigaciones recientes presentaron a los exosomas como nuevas dianas terapéuticas. Los exosomas intrínsecos y de ingeniería pueden ser aplicados como agentes terapéuticos para detener la progresión de la enfermedad. Se señaló que los exosomas modificados genéticamente cargados con elementos específicos, como los miRNAs, pueden utilizarse como una posible opción terapéutica. O’Brien et al.63 en 2015, descubrió que los exosomas cargados con miR-134 pueden disminuir la migración y la invasión de células BC. Además, mejora la sensibilidad de las células BC a los agentes anti-HSP90, 17-AAG y PU-H7163 (Figura 2 A). miR-503 inhibe la proliferación de células BC y sus capacidades invasivas por CCND2 y CCND3 knockout. En cuanto a miRNA profiling, Bovy et al..64 identificaron que miR-503 estaba específicamente regulado al alza en exosomas liberados de células endoteliales después del tratamiento con PTX y epirubicina (EPB). Según su estudio, los exosomas endoteliales cargados con miR-503 podrían obstruir la proliferación de células tumorales y, de ese modo, contribuir al efecto directo de la terapia con taxanos y antraciclinas.64 (Figura 2 B). Un estudio in vivo en ratones RAG2 – / – mostró que los exosomas eran potentes para administrar let-7a al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que expresaba las células BC. Este estudio sugirió que los exosomas pueden usarse para atacar a las células BC que expresan EGFR mediante la eliminación de fármacos de ácido nucleico65 (Figura 2 C).

Por primera vez en 2015, Jenjaroenpun et al.66  caracterizó todo el contenido de ARN de los exosomas secretados por dos líneas celulares de BC metastásicas humanas. Ellos sugirieron que el análisis de ARN exosómico podría distinguir la línea celular BC metastásica baja (MDA-MB-436) de la línea celular BC metastásica (MDA-MB-231).66 Mediante la técnica de RNA-seq, se identificaron los perfiles de expresión de miRNA de BC metastásico, así como las líneas celulares mamarias normales. Con base en los múltiples algoritmos, se selecciona miR-105 para el análisis in vivo e in vitro.  Se indicó que los exosomas median la transferencia de miR-105, que rompe de manera eficiente las uniones estrechas célula-célula e induce metástasis. Además, la sobreexpresión de miR-105 en exosomas derivados de la línea celular BC no metastásica (MCFDCIS) indujo metástasis y permeabilidad vascular en ratones nulos.67 En conclusión, los exosomas pueden usarse en la administración de fármacos y la terapia dirigida de las células BC, o dirigirse a la inhibición de las vías de señalización del cáncer.

En algunos estudios, se evaluó el papel de los exosomas en la resistencia de BC al tratamiento. La proteína 1 asociada al carcinoma urotelial (UCA1) ejerce un efecto regulador sobre la quimio resistencia de diferentes células cancerosas (p. ej., cáncer gástrico, vesical y colorrectal).68-70 En 2016, Xu et al.71 compararon la cantidad de ARNm de UCA1 en exosomas liberados de tamoxifeno sensible (MCF7) y células BC (LCC2) resistentes. Se detectaron niveles significativamente mayores de UCA1 en células LCC2  y sus exosomas. Curiosamente, los exosomas liberados por LCC2 tenían mayor expresión de UCA1 que las de las células parentales LCC2. Ellos concluyeron el papel de la transferencia exosomal de UCA1 en la inducción de la resistencia al tamoxifeno en células MCF-771 (figura 3 A). Boelens et al.72 demostró que la regulación positiva de la proteína RAB27B dio lugar a una sobre liberación de exosomas en células estromales. Estos exosomas inducen la proteína STAT1 en las células BC adyacentes y activa las vías NOTCH3. Todos estos procesos dan lugar a la quimio resistencia y la resistencia a la radiación en las células BC.72 (Figura 3 B). En este sentido, y utilizando datos de RNA-seq, los científicos evaluaron los modelos de xenoinjerto derivados de pacientes de BC para predecir la respuesta de la quimioterapia.73 En resumen, los exosomas y las células estromales de las células BC, afectados por un nicho de cáncer, transfieren mensajes intercelulares para mantener el nicho de células cancerosas.

Materiales genéticos exosómicos en otros cánceres

Los investigadores estudiaron otros exosomas de cáncer en diferentes bio fluidos. Algunos de los estudios acreditados que se centran en células que no son de BC se resumen en la Tabla 1. El estudio sobre muestras de suero muestra las ventajas de estas vesículas como posibles fuentes de biomarcadores en diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo, el estudio de Taylor et al..74 demostró que la firma en los miRNAs exosómicos circulantes reflejaba con precisión los perfiles tumorales. Por lo tanto, la proyección de ARNm exosomal puede realizarse como un procedimiento de diagnóstico alternativo.74 Además, un estudio sobre glioblastoma multiforme en muestras de suero de pacientes indicó que el exosomal miR-320, miR-574-3p y RNU6-1 podrían servir como biomarcadores de diagnóstico para la detección temprana y el monitoreo de la enfermedad.15 Otro estudio sobre exosomas serales de pacientes con melanoma mostró una asociación entre la regulación negativa del miR-125b circulante y la progresión de la enfermedad.75 El miR-1246, miR-3976, miR-4644 y el miR-4306 seleccionados fueron significativamente regulados al alza en el 83% de los exosomas serales de adenocarcinoma pancreático, en comparación con los del grupo de control.76 Estudios similares sobre cáncer de esófago, meningioma y cáncer de próstata revelaron evidencia a favor del uso de exosomas en el diagnóstico de cáncer o en la investigación de la comunicación de célula a célula.38,77

Además de los estudios de suero, la investigación sobre exosomas de orina mostró resultados prácticos significativos para predecir el estado del cáncer. Una nueva firma de triple ARN en el cáncer de próstata puede discriminar el puntaje 7 de otros puntajes en la primera biopsia y reducir el muestreo innecesario.78

Además de los estudios sobre diferentes fluidos biológicos, existen algunas evaluaciones sobre los exosomas derivados de líneas celulares. Por ejemplo, la comparación de líneas celulares normales y de cáncer de próstata mostró la presencia de un patrón miARN específico en los exosomas de cáncer.79 Los resultados de otro estudio sugirieron que la línea celular de cáncer gástrico metastásico liberó los miRNA de la familia let-7 a través de exosomas en el entorno extracelular para conservar su oncogénesis.80

Las proteínas exosómicas específicas en una línea celular de cáncer color rectal pueden proporcionar la comprensión de la biología del cáncer de colon y la posible detección de marcadores biológicos para el cáncer.81 En 2016, los investigadores reportaron 570 proteínas como un perfil de proteína exosomal que consiste en varias proteínas de señalización relacionadas con el cáncer, antígenos tumorales y reguladores secretados. También se demostró el valor funcional de los exosomas tumorales en la promoción de la angiogénesis y la migración celular.82

Protocolos de aislamiento de exosomas

Al igual que en todas las áreas recién descubiertas, los exosomas deben validarse en diferentes aspectos, especialmente en la significación clínica. El requisito previo para este nivel es desarrollar métodos estándar para aislar, caracterizar y extraer materiales biológicos. Con base a lo discutido, a continuación se detallan estas técnicas (Tabla 2).

Existen diferentes protocolos de aislamiento de exosomas basados en los tipos de muestras iniciales y experimentos descendentes preferidos con sus propias ventajas y desventajas. La muestra de partida podría ser un medio de cultivo celular o uno de los fluidos biológicos, y los exosomas aislados se evalúan en términos de función o contenido, incluidas las proteínas, los ADN, los ARNm y los ARN no codificantes, como los miARN. Aunque la técnica de centrifugación diferencial es el método estándar de oro para purificar exosomas,83,84 las diferentes viscosidades de la muestra y el requerimiento de equipo especial hacen que este método sea poco eficiente y restringido.84 En los fluidos de alta viscosidad, la velocidad y la duración de la centrifugación deben aumentarse, o los fluidos deben diluirse para disminuir la viscosidad, ya que las muestras con alta viscosidad tienen una menor eficiencia de sedimentación.85Debido a que el plasma es más viscoso que el suero, el protocolo de ultra centrifugación modificada podría usarse para purificar los exosomas al reemplazar la filtración única con el primer paso de la centrifugación en plasma.86 En general, el plasma tiene mayor viscosidad que el suero, y el suero tiene mayor viscosidad que los medios de cultivo y el PBS tiene la menor viscosidad.

Aunque este método mejora la tasa de recuperación, la contaminación con proteínas de los medios y una gran cantidad de muestra de inicio no fue práctica para el análisis proteómico y el uso clínico. Para omitir partículas grandes y desechos de las muestras, la agregación del paso de filtración a la ultra centrifugación puede mejorar la extracción exosomal, especialmente en estudios que planean analizar los ARN.87 La centrifugación en gradiente de sacarosa para una mayor pureza de extracción y rendimiento se introdujo en función de las diferentes densidades de flotación de los exosomas en 1997.88 Cantin et al.89   en 2008, modificó este método utilizando el gradiente de iodixanol (OptiPrep) para separar los exosomas de los virus que se superpusieron en densidad y rango de tamaño.

El descubrimiento de marcadores de proteínas de exosomas específicos en diferentes estados biológicos, de normales a enfermos, especialmente en el cáncer, dio lugar al desarrollo de técnicas basadas en la inmunoafinidad, que pueden aislar exosomas de pequeños volúmenes de muestra.28 Las perlas magnéticas o de látex recubiertas son de los antígenos específicos utilizados para purificar los llamados exosomas. Este método funciona más rápido con más eficiencia, lo cual es importante en entornos clínicos.90-92

Se fabricaron dispositivos micro fluidos para cubrir los defectos de los métodos actuales de aislamiento de exosomas; enfoques como la separación inmunológica, el tamizado y la captura de los exosomas son algunos ejemplos de las funciones de tales dispositivos. La simplicidad, la especificidad, la eficiencia y la alta pureza de estas técnicas de aislamiento con pocos pasos, que pueden funcionar con un volumen ligero de muestras y reactivos de inicio, los hacen interesantes para la investigación y los entornos clínicos.93 Además, el kit comercial es otra opción que aísla de forma rápida y sencilla los exosomas de pequeños volúmenes de diferentes muestras de partida mediante reactivos químicos, lo que los hace ideales para fines patológicos. Se recomiendan reactivos comerciales si el volumen de la muestra inicial tiene un límite; esta técnica es adecuada para aislar exosomas de menos de 500 ml de volumen inicial.94 Algunos reactivos de purificación son eficientes para futuros análisis posteriores salvo para el análisis de proteínas, a menos que se realicen pasos sucesivos de ultra centrifugación y filtración para eliminar las proteínas no específicas.95 Por lo tanto, el mejor método de aislamiento de exosomas debe emplearse en función del tamaño y tipo del volumen de muestra inicial y el análisis posterior planificado.

El principal objetivo de los estudios sobre los métodos de aislamiento de los exosomas es dar un paso adelante en su aplicación clínica. Existen algunos desafíos sobre los métodos de aplicación clínica de los exosomas como fuentes de biomarcadores. Primero, en función del tipo de cáncer, se debe seleccionar el biofluido adecuado. El bio fluido seleccionado debe ser accesible a través de un procedimiento no invasivo o poco invasivo, y los biomarcadores intencionados son detectables en una cantidad médicamente segura del bio fluido. Por ejemplo, Cheng et al.36 mostró que los exosomas de diferentes fracciones de muestra de sangre representaban diferentes perfiles de miARN. Por lo tanto, un biomarcador detectable en un determinado biolíquido puede no ser identificable en otro. Segundo, se debe desarrollar un procedimiento estándar para aislar exosomas de manera precisa y específica. En otras palabras, un procedimiento ideal debería aislar con precisión los exosomas de las otras vesículas y partículas extracelulares, y las EEB de otros exosomas específicamente. Por ejemplo, el estudio de Caradec et al.96 se investigó la posible contaminación de exosomas serales con proteína albúmina. En tercer lugar, el proceso de aislamiento del exosoma en la clínica tenía que ser repetitivo, rápido, fácil de manejar, barato y aplicable a diferentes tipos de exosomas específicos del tejido. Cuarto, un método de aislamiento de exosoma perfecto debería tener una tasa de error baja y un rendimiento de recuperación más alto.97 Hasta la fecha, no se ha introducido ningún procedimiento de aislamiento de exosomas aprobado para el entorno clínico. Algunas empresas recomendaron un kit de aislamiento de exosomas preclínicos (como Exoquick-CG; SBI), que debe validarse a través de ensayos clínicos, y los próximos resultados deben compararse y ser compatibles con los de los informes de patología.

Caracterización del exosoma

Existen varios métodos para distinguir los exosomas extraídos de otras vesículas (Tabla 3). La cromatografía de líquidos, la espectrometría de masas, el análisis de inmunotransferencia, el flujo de citometría, la inmunotransferencia de Western y el ensayo de transferencia puntual son comunes para verificar los marcadores de exosomas. La caracterización basada en la forma y el tamaño de las partículas se realiza mediante microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica (AFM),98,99 análisis de seguimiento de nano partículas (NTA), análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS), qNANO GOLD,100 y enfoques ELISA. Recientemente, se desarrolló el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA) para detectar exosomas, dirigidos a las tetraspaninas CD9, CD63 y CD81 en sus membranas. Algunos estudios llevan acabo muestras western blot en exosomas para indicar la falta de marcadores moleculares de micro vesículas (CD29, CD40 y p-selectina) y marcadores moleculares del retículo endoplásmico (calexina), y se confirmó que específicamente aislaban exosomas.42

Conclusiones

Hoy en día, los exosomas llaman la atención por ser una posible fuente para el descubrimiento de nuevos biomarcadores para diferentes enfermedades, incluido el cáncer. Un biomarcador de cáncer perfecto puede mostrar la existencia de masa tumoral y sus características moleculares en las primeras etapas. Los exosomas tienen propiedades especiales, que los convierten en una herramienta ideal para la biopsia líquida mínimamente invasiva. Estas partículas subcelulares son detectables en casi todos los fluidos biológicos; por lo tanto, de acuerdo con el tipo de cáncer, los investigadores pueden seleccionar un bio fluido especial para detectar los exosomas de los pacientes. El protocolo de aislamiento adecuado se debe aplicar según el análisis posterior, el tipo y el volumen de la muestra inicial. Los exosomas contienen proteínas, ARN y ADN, que podrían indicar las características biológicas y patológicas de la masa tumoral en el estado en tiempo real. Hasta hoy, se sugieren muchos biomarcadores exosómicos candidatos para BC, pero ninguno está aprobado todavía. Se ha demostrado el papel de los exosomas para inhibir la proliferación y la elevación de la respuesta a la quimioterapia en las células BC. Además de los efectos represivos de los exosomas en las células BC, los exosomas diseñados se dirigen específicamente a las células BC, reducen de manera concluyente los efectos secundarios de la quimioterapia en las células normales y aumentan la respuesta de la quimioterapia y la vida media del fármaco en circulación. Por otro lado, los exosomas de células BC inducen características oncogénicas en células mamarias normales y resistencia a la quimioterapia y radioterapia en células BC quimiosensibles. Estos exosomas activan las vías de señalización, que conducen a la migración y la metástasis en células BC no invasivas, pero los mecanismos relacionados aún no han sido validados. Aún hay un largo camino por recorrer para que los científicos descubran procedimientos confiables para diagnosticar, tratar y monitorear la AC a través de una biopsia líquida basada en el exosoma específica del cáncer. Para eliminar el efecto de los exosomas celulares normales, se deben desarrollar métodos de aislamiento y caracterización, y en función del líquido de origen, se debe lograr un consenso. Los expertos en biología y bioingeniería deberían cooperar para avanzar en las tecnologías basadas en exosoma.