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Reparación de ligamentos y tendones mediante el uso de células madre mesenquimales

Resumen: Uno de los regalos de la Naturaleza para la humanidad son las células madre mesenquimales (CMM). Son de naturaleza multipotente y están presentes literalmente en todos los tejidos. Dado que, poseen ciertas características de las células madre, como la auto-regeneración y diferenciación, se sabe que son las protagonistas principales en la homeostasis del tejido normal. Esta nueva función de las células madre mesenquimales ha sido explorada por científicos en el campo de la medicina regenerativa. Esta revisión da una perspectiva sobre las distintas fuentes de células madre mesenquimales disponibles para la ingeniería de tejidos con respecto a los tendones y ligamentos y el mecanismo involucrado durante la regeneración.

INTRODUCCIÓN

El primer científico que hace más de un siglo estableció la presencia de células madre (no hematopoyéticas) en la médula ósea lo que significó un papel importante en la curación de heridas fue Cohneim [1]. Posteriormente, el trabajo de Friedenstein y sus colegas estableció que ciertas células eran capaces de diferenciarse en el tejido óseo y también reconstituir un microambiente hematopoyético en los trasplantes subcutáneos. Los hallazgos anteriores fueron respaldados por varios científicos, que ciertas células madre presentes en la médula ósea humana eran capaces de diferenciarse in vitro en diferentes linajes mesenquimales [1, 2-5]. Estudios previos han demostrado que las CMMs se originan a partir de la cresta neural y el mesodermo. Durante un estudio sobre el potencial de desarrollo de la Cresta Neural de Codorniz, se observó que las células progenitoras de la cresta neural poseían características de las células madre que se observaron incluso en sus células diferenciadas, lo que sugiere un posible papel potencial en la regeneración de tejidos [6]. Se ha descubierto que las CMMs están presentes en casi todos los tejidos. Una de las características importantes de las CMMs es su capacidad de auto-regenerarse y diferenciarse en múltiples tipos de células (Fig. 1). Esta propiedad de las CMMs desempeña un rol crucial durante la homeostasis del tejido normal, en la que se regeneran nuevos tejidos cada vez que existe un daño interno debido a inflamación, fracturas, traumatismo y tumores [7]. Siempre que haya una lesión o daño en las células, el cuerpo envía señales que activan las CMMs, reclutándolas en el lugar de la lesión o daño, donde el microambiente que abarca muchos factores, como las citoquinas (TNF-a, IL-1, IFN-a), toxinas de agentes infecciosos y la hipoxia activan las CMMs para liberar ciertos factores de crecimiento [8-11]

Estos factores de crecimiento, a su vez, desempeñan un papel vital durante la formación de fibroblastos, células endoteliales y células progenitoras, que son los principales protagonistas que contribuyen a la regeneración de tejidos [12]. Estudios recientes han demostrado que las células Stro-1 positivas derivadas de la médula ósea se diferencian en múltiples linajes de células madre mesenquimales, como las células estromales hematopoyéticas y también los adipocitos, osteoblastos y condrocitos [13].

Las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea se caracterizaron en función del perfil de expresión de citoquinas. También se caracterizaron además por la expresión de ciertos marcadores tales como, CD105, CD90, CD73 y la molécula de adhesión CD166. Por el contrario, los marcadores hematopoyéticos estaban ausentes [14-16].

FUENTES DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES

Es bastante evidente, desde finales del siglo XIX que la investigación preclínica y clínica dependía únicamente de las células progenitoras mesenquimales derivadas de la médula ósea. Sin embargo, las células madre mesenquimales han sido aisladas de diferentes tipos de tejidos conectivo, como el tejido adiposo, músculo, matriz del cordón umbilical, hígado y pulpa dental [17]. Un conjunto creciente de evidencia sugiere que las CMMs pueden aislarse de tejidos neonatales como la placenta, amnios y sangre del cordón umbilical (SCU). Se sabe también que estos tejidos neonatales albergan una variedad de población celular embrionaria o prematura, incluidas las CMMs, células madre/progenitoras endoteliales y las células madre hematopoyéticas. Presentan cualidades celulares biológicas superiores, como una mejor proliferación, vida útil potencial diferencial en comparación con las CMMs derivadas de la médula ósea [5].

Fig. (1). Las células madre mesenquimales se caracterizan por su potencial de diferenciación multi-linaje.

La membrana placentaria puede ser una buena fuente de CMMs que podrían ser utilizadas en la medicina regenerativa [18]. Los informes sugieren que las células endoteliales también pueden ser una fuente de células madre mesenquimales, ya que pueden transformarse a través de la sobreexpresión de ALK2 o su activación por TGFβ2 o BMP4 [19].

Estudios previos han reportado que las CMMs derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen características similares a las de las CMMs derivadas de fuentes adultas [20]. También tenían el potencial de diferenciarse en linajes mesenquimales, por lo que pueden ser utilizadas para la investigación clínica [21, 22]. Estudios recientes sobre las CMMs derivadas de tejidos fetales de ovejas (ovinos) se consideran una buena fuente para la regeneración de tejidos [23]. Los estudios también han demostrado que las células madre embrionarias humanas pueden ser una excelente fuente de células madre mesenquimales humanas que pueden ser utilizadas en la medicina regenerativa [24].

Un estudio muy reciente sobre las células madre mesenquimales de origen dental demostró que una considerable población de células madre mesenquimales está involucrada en el proceso de regeneración del diente y se encontró que estas células se derivan de la glía asociada al nervio periférico. Estas células gliales son conocidas por generar células madre mesenquimales multipotentes que producen células pulpares y odontoblastos [25]. Las CMMs dentales encapsuladas fueron desarrolladas para investigar su capacidad para diferenciarse en los tejidos de los tendones [26]. Los resultados mostraron un marcado aumento en la expresión de marcadores genéticos relacionados con la regeneración de tendones, como son Scx, DCn, Tnmd y Bgy. Los resultados in vivo mostraron una regeneración ectópica del neo-tendón en modelos subcutáneos trasplantados de CMM-alginato. Juntos, sus hallazgos sugieren que las CMMs encapsuladas anteriores podrían ser consideradas para la regeneración del tendón en estudios clínicos [26].

Recientemente, se utilizaron células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo alogénico (ASC) junto con plasma rico en plaquetas (PRP) para el tratamiento de caballos con tendinitis del tendón flexor digital superficial (FDS), los resultados mostraron que después de un seguimiento de 24 meses, el 89,5% de los caballos retornaron a la competencia con un 10,5% de nuevas lesiones. Este tratamiento no mostró ningún efecto secundario, como reacciones adversas crónicas graves en los tejidos ni ninguna formación de tejidos anormales a largo plazo, lo que sugiere que el tratamiento anterior podría considerarse un enfoque seguro y efectivo en el tratamiento de la tendinitis del FDS en caballos [27]. También se observó que se utilizaron células mesenquimales estromales de la médula ósea autóloga para el tratamiento o regeneración de ligamentos y tendones equinos lesionados. Los resultados mostraron que no hubo ningún efecto adverso del tratamiento con CMMs y trece de dieciocho caballos tratados retornaron a su actividad deportiva, demostrando la seguridad del tratamiento con CMM en los ensayos clínicos [28].

SEÑALIZACIÓN DE LAS VÍAS INVOLUCRADAS DURANTE LA REGENERACION DE LA REPARACIÓN DE TEJIDOS

Un conjunto creciente de evidencia sugiere que las células madre mesenquimales en el cuerpo humano son como el almacén para la regeneración de células, desempeñando así un papel vital en la homeostasis de tejidos. Como se discutió anteriormente, aparte de las lesiones/inflamaciones, citoquinas, microambientes de tejidos y factores de crecimiento, que regulan el destino de las CMMs, existen moléculas o vías de señalización que desempeñan un papel importante en la diferenciación de las CMMs que finalmente conduce a la reparación de los tejidos. Algunas de las vías de señalización importantes son Wnt/β-Catenina, BMP, TGF-β, Nell-1 y Notch.

La vía de señalización Wnt es una de las principales protagonistas durante el desarrollo que abarca alrededor de diecinueve receptores y correceptores Wnt que han sido identificados en siete familias de proteínas. La vía de señalización Wnt a través de vías tanto canónicas (dependientes de β-catenina) como no canónicas (independientes de β-catenina) han establecido actividades proosteogénicas y antiadipogénicas. La vía dependiente de β-catenina inicia con la unión de los ligandos Wnt extracelulares a los receptores frizzled de siete dominios transmembrana (Frz) expresados en la superficie celular. Por último, la vía de señalización Wnt dependiente de β-catenina provoca que la actividad transcripcional del gen influya en la determinación del linaje de CMM. La vía de señalización Wnt canónica tiene efectos bien establecidos sobre la masa ósea tanto en modelos animales como pacientes humanos. Se ha reportado un rol directo para la β-catenina en la regulación de la actividad de los osteoblastos y osteoclastos. La actividad SHH puede ser clave para estimular la osteoblastogénesis solo durante las fases tempranas de la diferenciación celular.   Un resultado previo sugiere que la señalización HH promueve la diferenciación osteogénica de CMM principalmente a través de la actividad del factor transcripcional Gli [29].

El correceptor-Wnt LRP6 (proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) es muy importante para la señalización Wnt 3a/ β-catenina y también es conocida por regular la diferenciación de las células madre mesenquimales humanas en el linaje adipogénico [30].

Se descubrió por primera vez que la molécula segregada NELL-1 (proteína NEL-like 1) tenía propiedades osteoinductivas por su sobreexpresión durante la formación prematura del hueso en la craneosinostosis coronal esporádica humana [31, 32]. NELL-1 se expresa durante la formación ósea tanto intramembranosa como endocondral. Se conoce que la sobreexpresión de Nell-1 desempeña un papel significativo en el desarrollo óseo. Se sabe que Runx2 se encuentra antepuesto a Nell-1 y se descubrió que ambas proteínas se expresaban a los mismos niveles y en cantidades significativas durante el desarrollo del esqueleto [33-35]. Se conoce que NELL-1 promueve la osteogénesis acompañada de la activación de MAPK, Wnt canónico y señalización HH [36-38]. Esta activación de la señalización MAPK está asociada con la fosforilación de la proteína Runx2 [36]. Además, la actividad MAPK inducida por NELL-1 se acompaña de la activación de los transportadores de fosfato Pit1 y Pit2 para aumentar la mineralización preosteoblasto. La inducción de la señalización Wnt por NELL-1 ha sido observada tanto en los tipos de células osteoblásticas como en las osteoclásticas y está asociada con sus efectos proosteogénicos y antiosteoclásticos

Las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs, por sus siglas en inglés) son citoquinas extracelulares originalmente aisladas de un fragmento óseo y que se ha descubierto que inducen la condrogénesis y osteogénesis ectópica. Las BMPs son responsables de numerosos procesos de regulación celular, incluida la diferenciación y el modelado de huesos y cartílago [39]. Se han identificado más de 20 diferentes BMPs, de las cuales BMP-2, -4, -7, -9 y -13 son las más estudiadas en el contexto de la diferenciación de CMM [40, 41]. Las BMPs producen sus efectos a través de la interacción con dos receptores BMP de superficie celular serina-treonina quinasa (BMPRs). Las BMPRs de tipo II inician la señalización al unirse a un ligando BMP, luego de lo cual se produce el reclutamiento, la fosforilación y la activación de las BMPRs de tipo I. Si bien existen varios tipos distintos de BMPRs tipo I, solo unos pocos están involucrados en la diferenciación de CMM, incluidos BMPR-IA y BMPR-IB. La transducción de señalización Smad1/5/8 es la más significativa para la diferenciación de CMM, ya que es principalmente a través de los complejos de proteínas Smad que la regulación transcripcional de la programación osteogénica está regulada [29]. Yu Dong et al., [42] demostraron que los tendones envueltos por bMSCs transfectadas con BMP2 tenían el potencial de mejorar la recuperación de los huesos/tendones.

La transformación de la señalización del factor de crecimiento-β juega un papel crucial en la biología evolutiva. Esta vía se activa a través de la oligomerización inducida por un ligando del receptor serina/treonina quinasa y la fosforilación de las moléculas de señalización citoplasmática como Smad2 y Smad3 por TbRI [43]. Los BMSCs humanos fueron inducidos para migrar hacia los lugares de resorción ósea por TGF-β1 y este proceso está mediado a través de la vía de señalización SMAD [44]. Por este motivo se propuso la vía TGF-β- TbRI- SMAD como una nueva vía de señalización involucrada en la migración de CMM. Los potenciales terapéuticos de las CMMs dependen de la migración de las CMMs desde la médula ósea u otros lugares de residencia a los tejidos distantes dañados, donde participan en la reparación y regeneración. De este modo, la migración de las CMMs está controlada por redes de señales complicadas [45].

Vía de Señalización Notch: La vía de señalización Notch humana es otra vía clave durante el proceso de desarrollo que incluye la determinación del futuro de la célula, proliferación y apoptosis. La vía de señalización Notch se activa una vez que el receptor de una célula interactúa con el ligando, tal como Delta-like o Jagged de la célula vecina, resultando en dos divisiones sucesivas que liberan la porción citoplasmática Notch (Notch-IC) [46]. El C-terminal de la vía de señalización Notch se traslada al núcleo y recluta la proteína CSL que activa los genes diana descendentes como Hes1 [47]. Se sabe que la vía de señalización Notch interfiere con otras vías osteogénicas, lo que conlleva además a la regulación de los osteoclastos [48]. Los estudios han demostrado que las proteínas de la seda sirven como una fuente nutricional que induce la vía de señalización Notch, que a su vez desempeña un rol vital en los efectos proosteogénicos y en la regeneración ósea durante las fracturas y la osteoporosis [49].

Los estudios han demostrado que Rho GTPasa es un mediador importante en la migración de células madre mesenquimales y desempeña un papel crucial durante el desarrollo del tendón y ligamentos, y esto ocurre cuando son sometidos a estiramientos mecánicos. Las moléculas de señalización tales como RhoA/ROCK y FAK participan en la diferenciación de hMSC [50].

REPARACIÓN DE LIGAMENTOS Y TENDONES UTILIZANDO CÉLULAS MADRE MESEQUIMALES

Un conjunto creciente de datos sugiere que las células madre mesenquimales, junto con diversos factores de crecimiento y de diferenciación, son una gran fuente de valor terapéutico en términos de regeneración de tendones y ligamentos. Los estudios han demostrado que las CMMs transducidas con dos genes implicados durante el desarrollo de los tendones durante la embriogénesis, es decir, la escleraxis [51] y las membranas tipo 1-metaloproteinasa de matriz (MT1-MMP) [52] mostraron una mejor recuperación de los tendones.

La ingeniería de tejidos fue definida oficialmente en 1988. [53]. La curación de los tendones se produce a lo largo del tiempo y comprende tres etapas [54]. Durante el inicio del proceso de cicatrización del tendón, incluye una etapa inflamatoria en la que hay formación de hematomas, infiltración de glóbulos blancos, liberación de citoquinas y factores de crecimiento. Los fibroblastos empiezan a aparecer en esta fase y los macrófagos eliminarán cualquier deshecho, la segunda etapa implica la proliferación, donde los fibroblastos producen principalmente colágeno tipo III y se forman nuevos vasos sanguíneos. La etapa final es la maduración, donde los colágenos se entrecruzan y el tejido se vuelve más organizado. El tendón volverá a su capacidad original a las 3-4 semanas y su máximo a los 6 meses [55].

Los estudios in vivo con ratones NOD/SCID mostraron que las CMMs fueron utilizadas para curar defectos segmentarios en diversos animales [56, 57]. Los informes mostraron que los niños que sufren de osteogénesis imperfecta fueron tratados mediante la infusión de células de la médula ósea, que son una fuente valiosa de CMMs, y finalmente fueron restablecidos a la normalidad [58, 59]. Las CMMs presentan una señalización paracrina que a su vez libera factores de crecimiento como el TGF-beta, VEGF, FGF y otros factores de señalización esenciales para la reparación de tejidos [60]. Un gran conjunto de evidencia sugiere que se requieren condiciones hipóxicas para el mantenimiento de las células madre. Los estudios con respecto a las células madre del tendón humano también prueban que la condición hipóxica es un factor especializado importante que es esencial para regular las características principales de las hTSCs [61]

Las vías de señalización BMP2 y SMAD8ca desempeñan un papel en la síntesis de los componentes de la matriz secretada que son esenciales para formar una estructura de colágeno altamente ordenada y la matriz extracelular (MEC). Junto con las vías de señalización anteriores, la interacción entre las metaloproteasas de matriz (MMP) y los inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMPs) desempeña un papel clave en la formación de la estructura de colágeno de los tendones y ligamentos. Se encontró que las células madre humanas inducidas pluripotenciales (IPS-MSC) exhibían características notables como la inhibición de la proliferación de células natural killer y la función citolítica al disminuir los niveles de marcadores de activación y la señalización ERK1/2.

Se encontró que las IPS-MSC son más resistentes a las células natural killer (NK) pre-activadas que las CMMs derivadas de la médula ósea. Por lo tanto, las IPS-MSC pueden ser una fuente valiosa para la medicina regenerativa y puede desempeñar un papel importante en la prevención de rechazo de aloinjertos [62]. Las CMMs inducen tolerancia inmunológica activando las células T tipo 1 reguladoras. Las CMMs derivadas de la MO han sido establecidas para suprimir las respuestas inmunológicas in vitro al disminuir las células T activadas y citotóxicas. Se sabe que promueven la generación de células T reguladoras (Tregs) y modulan la maduración o función de las células dendríticas [63]. Los reportes han demostrado que el tratamiento con la infusión de CMMs autólogas y alogénicas ha sido eficaz en la regeneración de tejidos y la modulación de enfermedades [64].

CONCLUSION

Las células madre mesenquimales son, por lo tanto, una fuente valiosa para la regeneración de tejidos y, en particular, para la reparación de ligamentos y tendones. Las células madre de los tendones humanos (hTSC) requieren la presencia de una condición hipóxica como factor especializado para el mantenimiento de sus principales características, este factor puede ser utilizado para expandir hTSC ex vivo, de modo que se pueda usar para regenerar diversas lesiones tisulares relacionadas a los tendones y ligamentos. Investigaciones recientes indican que las IPS-MSC pueden ser una gran fuente de células inmunorreguladoras; sin embargo, en términos de dirección de investigación futuras, pueden ser una valiosa fuente para varias enfermedades, ya que tienen el potencial de prevenir el rechazo de aloinjertos.

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